Роль донорского химеризма в развитии посттрансплантационных рецидивов

у детей с острыми лейкозами

Исследование посттрансплантационного химеризма является ключевым фактором эффективности аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (аллоТГСК) у пациентов с различными онкогогематологическими заболеваниями. Вместе с тем, прогностическое значение полного замещения гемопоэтического пулла клетками донора не до конца ясно. Отсутствует четкое понимание клинического значения кинетики замещения клеток опухолевого клона клетками донора. В настоящее время не разработан универсальный и наиболее эффективный метод диагностики химеризма, обладающий высокой точностью и чувствительностью. Анализ химеризма в большинстве исследований поводился методом полимеразной цепной реакции STR (STR-ПЦР), который надежен и с хорошей воспроизводимостью и точностью, однако имеет низкую чувствительность 1-5%. Метод ПЦР в реальном времени полиморфизмов инсерция/делеция (InDel-ПЦР) более чувствительный (0,01%), однако имеет ограниченную воспроизводимость при высоком проценте клеток реципиента (Лавриненко В.А., 2014).В данной работе будет использована комбинация методов определения химеризма (STR-ПЦР и InDel-ПЦР), которая позволит увеличить чувствительность и сохранить точность исследования. Предполагается, что метод InDel-ПЦР позволит предсказать развитие рецидива в более ранний период, чем STR-ПЦР.Актуальным является также определение порогового значения уровня химеризма, которое позволит наиболее рано выявить группу риска. В настоящее время нет единого мнения о том, какие изменения уровня химеризма считать значимыми, так как разные исследователи принимают различные значения для смешаного и полного донорского химеризма от 0,5% до 5% клеток реципиента (Rettinger E., 2011). (Imahashi N., 2015) .

Выявление ранних признаков возврата заболевания (уменьшения донорского химеризма, нарастание МОБ и др.) является важнейшей задачей для раннего предотвращения посттрансплантационных рецидивов. 

Целью данной работы является изучение роли изменения донорского химеризма в раннем предсказании развития рецидивов у детей с острыми лейкозами после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Полученные результаты:

1. Разработана система для определения донорского химеризма на основе InDel полиморфизма. 

При анализе чувствительности исследуемых маркеров было выявлено, что для STR маркеров минимальным значением выявляемой генетически-гетерогенной популяции является 1%, в то время как чувствительность системы, базирующейся на анализе InDel маркеров достаточна для выявления 0,01% минорной популяции клеток. При постановке реакции вносили 100 нг ДНК, что эквивалентно 15000 клеткам – исходя из среднего содержания 6,6 пг ДНК в клетке. Таким образом, расчетное значение чувствительности данной системы составляет 0,007%. При оценке результатов исследования обращает на себя внимание различие в амплификации InDel-маркеров – от 27,81% до 71,15% при изначальном соотношении двух типов анализируемых клеток 1:1. Подобная тенденция сохраняется и в других разведениях. Это обусловлено тем, что допустимая вариативность в 0,5 Ct может интерпретироваться как изменение концентрации ДНК (значений ДХ) на 50%, что, в свою очередь, является недопустимым при оценке ДХ в интервале от 5 до 95%.  

При анализе ДХ по STR локусам также наблюдается вариабельность значений при использовании различных маркеров, так при оценке 50% разведения значения ДХ колебались от 39,84 до 44%, что обуславливает необходимость проведения исследования ДХ по меньшей мере по 3 маркерам. Коэффициент вариации, составивший для STR локусов от 0,05 до 0,29 сопоставим лишь с результатами по InDel, полученными при анализе разведений от 0,01 до 5%. 

Таким образом, несмотря на более высокую чувствительность, наличие ограничений в оценке количественных значений уровня донорского химеризма с использованием InDel полиморфизмов, указывает на целесообразность применения данного подхода только при оценке остаточных популяций клеток реципиента после трансплантации, в то время как анализ высокополиморфных STR маркеров позволяет оценивать более прецизионно значения донорского химеризма в интервале от 5 до 95 процентов, что является более значимым в рутинном посттрансплантационном мониторинге. С другой стороны, при проведении предварительной селекции ранних предшественников, использование высокочувсвительного метода исследования может обладать большей клинической значимостью. Представляется целесообразным проверить это предположение в следующем году.

Также на основе InDel маркеров была отработана методика оценки ДХ с использованием цифровой ПЦР, показавшей существенно более высокую воспроизводимость значений по каждому из исследуемых маркеров в широком диапазоне – от 0,1 до 95%.

2. Нами была выявлена во многом сопоставимая динамика восстановления донорского химеризма вне зависимости от выбора режима кондиционирования. Лишь на 15 день после трансплантации при проведении миелоаблативного режима кондиционирования достижение полного донорского химеризма было зарегистрировано у большего количества пациентов. При проведении исследования не удалось выявить различий в приживлении клеток в зависимости от совместимости по системе главного комплекса гистосовместимости.

Мы не выявили существенных различий в скорости достижения полного донорского химеризма в зависимости от вида трансплантата – ядросодержащих клеток костного мозга и периферических стволовых клеток, как на фоне миелоаблативных, так немиелоаблативных режимов кондиционирования, в то время, как количество трансплантируемых гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) оказывает более выраженное влияние на кинетику приживления трансплантата. Так при трансплантации CD34-положительных клеток, численностью более 2 млн на 1 кг веса реципиента уровень донорского химеризма в анализируемой выборке был выше на 7, 14, 21 и 30 день после ТГСК.

3. При анализе прогностической значимости достижения донорского химеризма наивысшие показатели выживаемости (75%) оказались у пациентов, достигших полного донорского химеризма на 60 день, в то время как выживаемость у пациентов, не достигших полного донорского химеризма составила не более 20% (p=0,01). ). В группе пациентов со смешанным химеризмом наибольшее значение имеет стабильность уровня донорского химеризма, которая обуславливает лучшую выживаемость (p=0.09) и более низкую вероятность развития рецидива (p=0.013). При этом у пациентов со стабильным смешанным химеризмом выявление молекулярных маркеров минимальной остаточной болезни не оказывает существенного влияния ни на общую выживаемость, ни на вероятность развития рецидива (p=0.55 и p=0.34 соответственно). Промежуточный итог нашего исследования: мониторинг донорского химеризма после алло-ТГСК адекватно отражает динамику приживления донорских клеток и может служить адекватным методом прогнозирования развития рецидива, но в то же время не может быть использован в качестве единственного метода при анализе минимальной остаточной болезни. 

4. Оценка уровня донорского химеризма определяет также и эффективность инфузии донорских лимфоцитов (ИДЛ), иммуноадаптивной терапии, позволяющей элиминировать клетки опухолевого клона и предотвратить развитие рецидива заболевания. Нами было показано, что ИДЛ эффективна при уровне химеризма не менее 30%. 

5. При сопоставлении количественных данных донорского химеризма и МОБ на основе экспрессии химерных транскриптов BCR-ABL, MLL-AF4, TEL-AML1 была выявлена обратная корреляционная зависимость. Однако для транскриптов CBFB/MYH11, AML1/ETO, PML/RARa, MLL/AF9, SIL/TAL подобной закономерности выявить не удалось. 

6. Одним из возможных перспективных подходов в оценке эффективности терапии является использованием экспрессионных маркеров. Ключевым отличием от исследования химерных транскриптов – «золотого стандарта» современной оценки минимальной остаточной болезни является анализ экспрессионных маркеров, в норме экспрессирующихся в гемопоэтических предшественниках. Однако, несмотря на более низкую специфичность ананлиз экспрессионных маркеров является перспективным в силу довольно широкой распространенности.

С целью оценки возможности использования панели экспрессионных маркеров в оценке вероятности развития рецидива после аллоТГСК было проведена оценка уровня экспрессии генов WT1, BAALC, EVI1, PRAME, MN1, ERG и донорского химеризма, а также уровня химерных транскриптов проводилась методом RQ-PCR.В исследование было включено 63 пациента в возрасте от 1 до 60 лет с острым миелобластным лейкозом, которым была выполнена аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. По данным экспрессии генов у здоровых доноров мы рассматривали в качестве порогового уровень экспрессии (эксп. ген/ABL x100) значения для WT1 – 250, для EVI1- 10, для BAALC – 20, для PRAME – 200. У пациентов, которым была выполнена трансплантация в рецидиве мы отметили наличие гиперэкспрессии генов EVI1 (p=0.006), WT1 (p<0.001), BAALC (p<0.001). Сходная тенденция наблюдалась и в отношении гена PRAME (p=0.08). При этом наличие гиперэкспрессии гена EVI1 наблюдалось у 6 пациентов (33%), WT1 – у 13 пациентов (72%), BAALC – у 10 пациентов (55%) и PRAME – у 4 пациентов (22%). При сопоставлении данных экспрессии генов и уровня химерных транскриптов PML-RARa и RUNX1-RUNX1T1 была выявлена корреляционная зависимость (p<0.05). В то же время, мы не обнаружили данной зависимости при сопоставлении с данными экспрессии химерного гена CBFB-MYH11. При анализе специфичности исследования было выявлено, что при наличии химерного транскрипта менее чем в 2% клеток, позитивные ранее значения экспрессионных маркеров приобретают значения, сопоставимые с уровнем базальной экспрессии. При анализе уровня донорского химеризма была выявлена обратная корреляционная зависимость между уровнем донорского химеризма и экспрессией молекулярных маркеров рецидива заболевания - WT1 (p=0.0001), EVI1 (p=0.03). Таким образом можно заключить, что оценка экспрессии генов WT1, BAALC, EVI1, PRAME у пациентов с ОМЛ является перспективным подходом в оценке вероятности развития рецидива после алло-ТКМ. Вместе с тем, оценка минимальной остаточной болезни с использованием экспрессионных маркеров представляется проблематичной в силу наличия их базальной экспрессии в неопухолевых клетках.

Публикации:

И. М. Бархатов, А. И. Шакирова, А. В. Евдокимов, О. Г. Смыкова, Д. Е. Ершов, Л. С. Зубаровская, Б. В. Афанасьев. InDel-полиморфизм в количественной оценке посттрансплантационного химеризма //Ученые записки СПбГМУ им. акай. И.П.Павлова, том XXIII · N4 · 2016, стр. 40-45

Постеры:

1. Исследование кинетики донорского химеризма с целью оценки вероятности развития рецидива после алло-ТГСК у пациентов с острыми лейкозами.

2. Экспрессия генов WT1, BALC, PRAME, EVI1 и PRAME в оценке вероятности развития посттрансплантационных рецидивов у пациентов с острым миелобластным лейкозом

Работа выполняется при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (№16-54-00198)